核酸檢測是新型冠狀病毒肺炎確診的重要手段。為了解我國新型冠狀病毒（2019?nCoV）核酸檢測的開展現狀及質量狀況，國家衛生健康委臨床檢驗中心（以下簡稱“臨檢中心”）于2020 年 3 月 16 日~24 日開展了 2019?nCoV 核酸檢測室間質量評價，并將檢測結果進行了統計分析。

       本次臨檢中心下發了12個質評樣本，均為國家衛生健康委臨床檢驗中心制備，為基因工程方法制備的噬菌體病毒樣顆粒模擬樣本，無生物傳染危險性，其濃度采用數字PCR定量而來，樣本相關的信息如下：

全國返回855個實驗室結果

       本次共計 1296 家實驗室報名，考慮到物流郵寄、自建方法信息的完整性等因素，實際接受報名實驗室數共計 889 家，包括疾病預防控制中心、二級或三級公立醫療機構（含綜合醫院、?？漆t療機構、婦幼保健機構）、獨立醫學實驗室、海關所屬國際旅行衛生保健中心、試劑研發廠家、科研院所等，共覆蓋全國 31 個省份（含自治區、直轄市）。
       本次共計收到 855 家實驗室的結果，其中有效結果的實驗室數為 844 家（即回報結果完整、在截止日期內回報的結果），采用單試劑檢測的實驗室 759 家，采用兩種或兩種以上試劑檢測的實驗室 85 家，不同試劑檢測結果 931 份。

評價原則和結果

       “新型冠狀病毒核酸檢測”室間質量評價的評價原則如下：

       （1）假陰性結果：500 個copies/mL 以上濃度的 2019-nCoV 樣本均要求檢出， 包括202002、202004、202008 和 202011，未檢出為假陰性結果。
       （2）假陽性結果：2019-nCoV 陰性樣本，包括其它冠狀病毒陽性樣本，均應報告 2019-nCoV 陰性。報告 2019-nCoV 陽性為假陽性結果。
       （3）PT 成績計算： 202010 號樣本不計分。

       202001、202002、202004、202005、202006、202007、202008、202011、202012號樣本均要求與 2019-nCoV 預期結果相符，完全相符判定為實驗室為合格；否則，為不合格。采用兩種試劑檢測的實驗室，以最終結果判定實驗室成績是否合格（不單獨評價各試劑檢測結果）。

       （4）質評結果：本次質評中，共計收到 844 家實驗室的有效結果（即回報結果完整、在截止日期內回報的結果），其中合格實驗室 701  家（83.1%），不合格實驗室 143家（16.9%）。

結果統計

（1） 各樣本總體符合率和復檢率

（2）各實驗室使用的方法學差異

       使用方法包括包括實時熒光 RT-PCR、PCR-基因芯片、PCR-飛行時間質譜、轉錄介導的恒溫擴增、數字 PCR 和高通量測序方法（包括宏基因組測序）。但是實驗室基本上都使用實時熒光 RT-PCR 方法，其它方法由于回報結果少，100%符合也不能說明該方法具有優越性。

注：核酸檢測的假陽性通常由于標本間交叉污染和實驗室擴增產物遺留污染，但也可能是由特定試劑引物探針本身的特異性問題所致。

（3）各廠家產品差異
       不同試劑對 202011、202008、202004 和 202002 號陽性樣本的符合率和復檢率見表 6，202010 號樣本（128 copies/mL）共計 6 家實驗室檢出，2 家為圣湘生物、2 家為達安基因、2 家為自建方法（實時熒光 PCR、數字 PCR 法各 1 家）。
       核酸檢測試劑：97.5%（908/931）的回報結果使用實時熒光 PCR 法，各試劑的分析敏感性存在差異。NMPA 批準的試劑各陽性樣本（8×10 4 copies/mL， 1.6×10 4copies/mL, 3.2×10 3 copies/mL, 640 copies/mL）檢測的符合率總體好于使用自建方法的實驗室。

陽性樣本檢測結果的符合率和復檢率

不同品牌的試劑各靶基因檢出率

       各試劑不同靶區域的敏感性也存在差異。本次質評樣本為 ORF 區和 N 區連接在一起的病毒樣顆粒，因此 ORF 和 N 區的數量是完全一致的，但是試劑對兩個區域檢測的陽性率差異明顯。以回報結果數>10 份的試劑來看，總的來說，N 區的陽性率高于 ORF 區，樣本越弱，這一現象越顯著。

       目前各試劑有單靶標、雙靶標和三靶標檢測的方式，在疫情初期臨床病例數不足，方法設計尚無法進行充分的驗證。但是在現階段，試劑廠家應該已有一定數量的臨床數據，用來論證一些方法設計的依據是否科學。
       比如，要求兩個靶基因同時陽性，那么單個靶基因陽性的樣本，其中假陽性的比例有多少？造成假陽性的原因是什么？單靶標陽性必須要復檢一致，才能判定陽性，那么如果不復檢，會造成假陽性的比例有多少？造成假陽性的原因是什么？雙靶標或者三靶標檢測的作用，主要是為了提高檢測的敏感性還是特異性？是否存在多引物探針之間的競爭或者干擾？單靶標陽性的原因是什么？
      本次“ 全國新型冠狀病毒核酸檢測室間質量評價” 主要評價實驗室對2019-nCoV 核酸檢測的能力，重點考察實驗室檢測的分析性能，包括分析敏感性和分析特異性。
      室間質評采用基因工程方法建立的噬菌體病毒樣顆粒模擬樣本（本實驗室制備），無生物傳染危險性。該樣本適用于 NMPA 批準的新型冠狀病毒核酸檢測試劑，19 種未批準的商品化試劑和 32 家不同實驗室自建方法。
      

本次質評，共計 844 家實驗室回報有效結果，實驗室總體檢測情況良好，合格實驗室 701 家（83.1%）。同時也反映出一些問題，具體如下。
 
(1) 假陰性結果
       本次質評含有 5 份陽性樣本，分別為8×10 4  copies/mL，1.6×10 4  copies/mL,3.2 ×10 3 copies/mL, 640 copies/mL 和128 copies/mL。臨床研究表明，呼吸道和非呼吸道樣本中新型冠狀病毒載量平均為3.21×10 4  copies/mL（2.21×10 2~4.71×10 5copies/mL），呼吸道樣本中新型冠狀病毒載量平均4.33×10 4  copies/mL。
       另一研究表明，痰液樣本濃度較高（中位數 7.52 × 10? copies/mL），咽拭子樣本濃度較低（中位數 7.99 × 10? copies/mL）。由于能獲取痰液的患者有限，臨床上鼻咽拭子采樣更為普遍。因此，本質評樣本基本符合臨床樣本中病毒載量的情況。
       本次質評要求實驗室能夠檢出8×10 4 copies/mL，1.6×10 4 copies/mL, 3.2×10 3copies/mL, 640 copies/mL 四個濃度水平的樣本。各臨床實驗室在 1.6×10 4 copies/mL 以上濃度水平，符合率均可以達到97%以上，主要的問題存在于對3.2×10 3 copies/mL 和 640 copies/mL 兩個弱陽性樣本檢出能力。導致檢測假陰性的原因涉及核酸提取和檢測兩個過程。
       盡管實驗室一般會很關注檢測試劑的性能，但實際上核酸提取試劑的質量也是檢測成功的關鍵環節之一。本次質評中實驗室使用的核酸提取方法包括手工-柱提取法、手工-磁珠提取法、自動化儀器-柱提取法、自動化儀器-磁珠提取法和一步法等，各實驗室使用的核酸提取試劑種類超過 40 種，各檢測試劑均存在與多個核酸提取試劑搭配使用的情況。磁珠法核酸提取試劑逐漸成為主流，廈門普睿邁格生物科技有限公司作為專業的磁珠供應商，在核酸提取磁珠應用方面積累較多經驗，為核酸提取試劑生產商提供完善配套。
       核酸檢測從提取到完成擴增檢測是一個體系，但是如此多的核酸提取試劑，各種不同的操作程序，各實驗室的檢測體系實際上并不相同。因此，即使采用同一核酸檢測試劑，但由于核酸提取試劑的不同，檢測的分析敏感性也必然會存在差異。
       相同核酸提取純化試劑，各實驗室的檢測程序也有所不同。使用“中山大學達安基因股份有限公司核酸檢測試劑”的 224 家實驗室，58 家使用配套的“達安基因核酸提取純化試劑”，各實驗室使用的核酸提取的樣本量均為 200μL ，但洗脫體積包括 40、50、60、80、90 和 100μL 等。
       實驗室方面：各實驗室人員提取的操作能力存在差異，個別實驗室所有陽性樣本均未檢出。造成這一結果的主要原因，很可能是人員操作的問題，當然也不排除核酸提取試劑某一批次質量存在問題的可能性。部分實驗室盡管檢出陽性樣本，但是從報告的 Ct 值來看，實際上也存在較大差異。因此實驗室操作人員的培訓有待加強。
       一些實驗室在檢測過程中缺乏質量控制及對單靶標陽性樣本解讀的能力不足，這部分實驗室多開展臨床檢測時間不長，或者地區流行率低，日常檢出陽性樣本數極少。甚至使用相同試劑的實驗室對單靶標的處理方式也不同。

(2) 假陽性結果
      從質評結果來看，假陽性率較低，出現 2 例或 2 例以上假陽性的實驗室共 7 家（0.8%，7/844）。實驗室污染（擴增產物遺留污染和標本間交叉污染）在少數實驗室存在。部分試劑存在和其它冠狀病毒的交叉反應。
      綜上所述，我國目前臨床實驗室對 2019-nCoV 核酸檢測能力較強，同時也存在需要改進的方面，建議各試劑廠家根據目前臨床應用情況，總結臨床性能的數據；自建方法應加強對試劑性能的評價；臨床實驗室在開展檢測前或更換試劑批號時，應進行性能驗證，以發現不同試劑批號存在的差異以及驗證實驗室檢測能力；臨床實驗室應使用參與核酸提取過程的弱陽性樣本和多份（如 3 份） 陰性樣本，進行室內質量控制，以有效監測實驗室對弱陽性樣本的檢測能力和實驗室污染；臨床實驗室人員應加強實驗操作和結果解讀能力的人員培訓。


參考資料：臨檢中心《全國新型冠狀病毒核酸檢測室間質量評價結果報告》。
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