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一、概述
PuriMag Homo-NH2均勻的、但分散的表面具-NH 2官能團的超順磁微粒，由Fe3O4核和GMA涂層組成。通過GMA修飾，-NH2基團通過短的親水性連接臂連接到磁珠上。親水表面確保磁珠在各種緩沖液中具有出色的分散性和易操作性。表面具有反應性胺基的磁珠允許配體如蛋白質、肽、碳水化合物或其它特異性分子的固定。配體的固定可通過醛或酮的還原胺化而不預先活化磁珠表面?；蛘?，EDC交聯劑可用于羧基將配體與胺偶聯。最后，胺反應性雙功能交聯劑用于引入其它官能團以偶聯配體。
PuriMag Homo-NH2可以用肽、酶、碳水化合物等包被以分離不同的靶標，如激素、受體、凝集素、疾病標志物、噬菌體。一旦與配體結合后，將磁珠加到含目標分子的樣品中，短時間孵育后，可通過磁珠親和捕獲靶標。磁分離可除去不需要的上清液，洗滌目標結合的磁珠以得到純樣品。磁珠結合的靶標可直接用于生物測定，并在SDS-PAGE上分析。用常規洗脫方法可將目標分子從磁珠上洗脫下來。
二、產品特性
1. PuriMag HomoS-NH2
基團密度> 600 umoles amine/g beads
2. PuriMag HomoL- NH2
基團密度> 300 μmoles amine/g beads
形態：超順磁球形
直徑：1μm
儲存：10 mg/mL ，去離子水中 2~8 °C保存，勿凍結。
常溫運輸，正確使用保存期一年。
方案1. 用于連接醛和酮
含有醛和酮的配體可通過形成Schiff's堿與氨基磁珠偶聯，并用氰基硼氫化鈉還原胺化。醛基可通過高碘酸鈉氧化糖蛋白中的糖殘基或多糖中相鄰羥基的C-C鍵的裂解而容易地制備。
緩沖液
? 偶聯緩沖液 Coupling Buffer (0.1M sodium phosphate, 0.15M NaCl or 100mM sodium borate, pH9.5 or 100mM sodium citrate, pH9.5);
5M Sodium Cyanoborohydride in 1M NaOH;
0.1M Ethanolamine, pH7.4;
清洗氨基磁珠
1. 徹底重懸氨基磁珠并轉移足量磁珠到干凈EP管中。磁分離，并吸棄上清液。從磁力架上取下EP管，加入200μl偶聯緩沖液重懸磁珠。磁分離，并吸棄上清液。
2. 用上述緩沖液清洗兩次。
配體的結合
1. 將配體溶解偶聯緩沖液中至濃度1-10 mg/ml。
2. 將適量的配體加入洗過的氨基磁珠并混勻。
3. 每100μl反應混合物中加入1μl的5M氰基硼氫化鈉（溶于1M NaOH溶液），室溫下孵育2小時。磁分離，并吸棄上清液。
4. 加入反應混合物同體積的0.1M乙醇胺，并在室溫下旋轉孵育15分鐘。磁分離，吸棄上清液。
5. 加入適量的PBS并混勻磁珠。磁分離，吸棄上清液。
6. 重復步驟5兩次。
方案2. 用NHS交聯劑活化
最常見的一類活化劑是NH。根據交聯劑的性質，可與待固定的配體中的化學基團反應，包括胺、巰基、羧基和羥基以及非選擇性光反應。NHS交聯劑通常必須在使用前新配。與待固定的配體量相比，使用10倍摩爾過量。
偶聯緩沖液Coupling Buffer (0.1 M sodium phosphate buffer with 0.15 M NaCl, pH 7.4);
0.05 M Tris, pH 7;
氨基磁珠的活化
1. 用偶聯緩沖液重懸氨基磁珠。
注意：避免含有氨基的緩沖液如Tris或甘氨酸，因為它們會與NHS反應競爭。
2. 根據說明溶解NHS，并將所需體積加入磁珠，混勻?？蓪⑺苄訬HS直接加入磁珠中。終體積應等于瓶中最初的液體體積。
3. 室溫孵育30min。磁分離，吸棄上清。用上述緩沖液洗兩次。
4. 磁珠活化完成。
方案2-1. 用-NH2反應性的NHS-酯交聯劑活化后偶聯
使用同雙功能交聯劑時，第二個NHS-酯基團將與配體中的-NH2反應，因此通常用于固定肽或蛋白質的N-末端。步驟如下：
1. 重新懸浮活化的氨基磁珠。使用相同的緩沖液將體積調整到所需的磁珠濃度。
2. 加入計算后一定量的配體，混勻。
3. 室溫下孵育30分鐘或4°C下緩慢傾斜旋轉2小時。
4. 孵育后，將試管置于磁鐵上2分鐘，取出上清液。
5. 加入0.05M 的Tris（pH7）并在室溫下溫育15分鐘以猝滅未反應的活性氨基。
6.用偶聯緩沖液洗滌磁珠兩次。
方案2-2. 用-SH反應性的NHS-酯交聯劑活化后偶聯
巰基活性基團通常是吡啶二硫基或碘代/溴代乙?；?。寡核苷酸也可使用馬來酰亞胺。適當的緩沖液和孵育條件與巰基反應，配體須含待固定的游離巰基。
1. 重新懸浮活化的磁珠。根據所選的巰基反應基團使用緩沖液（請參見下表）。使用相同的緩沖液將體積調整到所需的磁珠/配體濃度。
2. 加入計算量的游離巰基配體，渦旋混勻。
3. 按下表推薦的時間和溫度孵育。
4. 孵育后，可加入半胱氨酸至終濃度為5mM以淬滅未反應基團。室溫下孵育15分鐘。
5. 如所述洗滌偶聯的磁珠。
SH-reactive group
Recommended buffer
Recommended condition
Maleimide
0.1M sodium phosphate pH 6.5-7.5
4 h at 4℃ or 2 h at room temperature
Iodo/Bromoacetyl
0.05M sodium borate pH8.3
1h, room temperature. Protect from light.
Pyridyldithio
Phosphate buffered saline (PBS) pH7.5
Over night at room temperature
方案2-3. 用光反應性的NHS-酯交聯劑活化后偶聯
光反應基團如羥苯基疊氮化物、硝基苯疊氮化物、苯疊氮化物或全氟芳基疊氮化物等可與胺基反應。帶有光反應基團的交聯劑的活化必須在暗室條件下進行。
1. 重新懸浮活化的氨基磁珠。根據活性基團選擇緩沖液。用相同緩沖液將體積調整到所需的磁珠/配體濃度。
3. 使用推薦的時間、溫度、適當波長的光照射。
注意：磁珠可能會熄滅光，因此須優化。
3. 將偶聯的磁洗兩次。
注意：磁珠與DMF等有機溶劑相容，上述活化和偶聯均可在干燥有機溶劑中進行。這將消除競爭性水解反應，因此通過延長反應時間可獲得更高產率。將磁珠從有機溶劑移至緩沖液之前，用純水洗滌一次。
方案3. 用具有胺和羧基反應性的交聯劑活化，以偶聯含羧基的配體
在配體中不存在其他伯氨基的條件下，可通過使用EDC或EDC / NHS（或其它碳二亞胺）將磁珠表面的胺基和配體中的羧基連接在一起。 EDC與羧基反應形成胺反應性中間體，該中間體在水溶液中不穩定。為了穩定，可引入NHS。
偶聯緩沖液Coupling Buffer (0.1 M MES, 0.5 M NaCl, pH 6.0);
注意：對于使用EDC的偶聯反應，避免使用含游離胺或磷酸鹽的緩沖液，因為這會干擾偶聯效率。Tris，乙酸鹽和甘氨酸緩沖液都易與EDC或偶聯中間體反應。還應避免含硫醇緩沖液，因為它們不可逆地結合EDC并抑制偶聯。
1-Ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl) carbodiimide hydrochloride (EDC);
Sulfo-NHS or N-hydroxysuccinimide (NHS);
封閉緩沖液Quenching Buffer (50mM Tris, pH 8.0 or 5-10mM Hydroxylamine);
PBS;
偶聯羧基配體
1. 偶聯緩沖液0.1 M MES (2-[N-morpholino] ethane sulfonic acid), pH 4.5–5 (or 0.1 M MES, 0.5 M NaCl pH 6.0) 洗滌磁珠。將EP管置于磁力架上60秒，并吸棄上清液。
2. 將配體溶解在上述偶聯緩沖液中至1–10 mg / mL的濃度，并加入推薦量的配體至上述磁珠，移液器吹打混勻。
3. 將10 mg EDC溶于1 mL冷去離子水中（或每mL溶解10 mg EDC和15 mg NHS）。
4. 注：EDC溶液和NHS溶液應新配，避光保存在冰上。
5. 每毫克配體，添加50–100μL的EDC（或EDC / NHS）溶液并渦旋。
6. 在室溫下孵育2h，或在4°C下緩慢傾斜旋轉孵育2h。
封閉磁珠
1. 加入500μl封閉緩沖液并重懸磁珠。室溫孵育30分鐘。
2. 將EP管置于磁力架上60秒，并吸棄上清液。
3. 加入500μl封閉緩沖液重懸磁珠。磁分離，吸棄上清。
4. 加入500μL的PBS（pH7.4）重懸磁珠。將EP管置于磁力架60秒，并吸棄上清液。重復洗滌2次。
5. 加入100μL的 PBS（pH7.4），重懸磁珠，4°C儲存。
附錄1：
A．免疫共沉淀分析
1. 將至少100μl含有靶抗原的細胞裂解物樣品加入到來自步驟6的磁珠管中并渦旋10秒。
2. 室溫孵育30分鐘或4°C過夜，輕輕搖動。磁分離，棄上清。從磁力架上取下試管，加入200μl洗滌液重懸磁珠。磁分離，棄上清液，從磁力架上取下EP管。再洗兩次去除未結合抗原。
3. 采用SDS-PAGE和蛋白質印跡分析，加入適量的SDS-PAGE上樣緩沖液并在95°C加熱磁珠5分鐘。將磁珠/上樣緩沖液混合物直接加到SDS-PAGE凝膠上，并按正常進行電泳和印跡。
B．抗體和抗原的排除：向磁珠、抗體、抗原混合物中加20μl洗脫液重懸磁珠。室溫下孵育2min。磁分離，收集上清液到新EP管，加入2μl中和緩沖液（如1M Tris-HCl，pH8.5）調pH。
